data di pubblicazione: 20 maggio 2022
di Riccardo Bugliosi
Con l’avvento della pandemia da SARS-CoV-2 abbiamo scoperto a livello globale i vaccini basati sull’mRNA (RNA messaggero). Il loro successo nell’universo della medicina ha reso possibile un enorme passo in avanti in direzione delle rivoluzioni che ci attendono con le terapie basate sull’RNA. Mediante questo approccio possiamo interagire con il meccanismo con cui le cellule del nostro organismo producono specifiche proteine sia potendone stimolare la produzione sia ‘spegnendola’ evitando così che risultino dannose per l’organismo medesimo.
In poche parole siamo capaci di veicolare un messaggio di tipo genico.
Per capire esattamente l’argomento di cui parleremo dobbiamo ricordare il meccanismo di base che sottende al funzionamento dell’RNA.
Sappiamo che le cellule sono gli elementi di base di un organismo vivente. Le nostre (eucariote) sono caratterizzate da differenti strutture specifiche sia per tipologia che per funzionalità (ad esempio quelle delle ossa, della pelle, dei muscoli, del sistema nevoso e via discorrendo). Tutte queste hanno sostanzialmente la medesima conformazione che è soprattutto caratterizzata dalla presenza del nucleo al cui interno troviamo il DNA e cioè l’acido nucleico deputato a codificare le istruzioni per lo sviluppo delle funzioni della cellula stessa. Queste informazioni si trovano in segmenti del DNA che chiamiamo geni. Dobbiamo considerare che tutte le cellule nucleate contengono identiche copie di DNA.
La domanda a questo punto è: se tutte le cellule contengono le stesse istruzioni come fanno ad esserci così tanti tipi di cellule? La risposta sta nel silenziamento del gene: l’informazione genetica può essere ‘spenta’. In questo modo durante lo sviluppo la cellula legge solo le istruzioni che sono necessarie per creare la sua specifica struttura ed esprimere le sue specifiche funzionalità.
Come sappiamo l’elemento chiave per convertire le informazioni genetiche del DNA in proteine è l’RNA messaggero (mRNA) che altro non è che una macromolecola biologica deputata al trasferimento delle informazioni.
Al fine di inattivare le istruzioni veicolate dall’mRNA la cellula utilizza una molecola, il microRNA, che è in grado di impedire l’espressione genica legandosi all’mRNA e quindi impedendo il suo funzionamento.
In questo modo i geni possono essere letteralmente ‘spenti’. È importante ricordare che il microRNA partecipa alla modulazione dell’attività cellulare in tutto l’arco della sua vita.
Il malfunzionamento del microRNA può avere serie conseguenze per il nostro organismo e può causare lo sviluppo di uno svariato gruppo di patologie che vanno dal cancro alle cardiopatie. Ha quindi un profondo impatto sulla nostra vita.
Come avviene per le proteine i geni che codificano per il microRNA sono contenuti nel DNA all’interno del nucleo. Nelle nostre cellule (eucariote) ogni gene è trascritto da un enzima chiamato RNA polimerasi-2 che, a partire da una sola delle due eliche di DNA, catalizza la sintesi dei vari tipi di RNA.
Entrando nello specifico lo sviluppo di terapie basate sull’RNA si basa in sostanza su due approcci: il silenziamento genico e l’utilizzo dell’RNA messaggero.
Utilizzo dell’mRNA (RNA messaggero)
Permette di ottenere la produzione endogena di specifiche proteine come nel caso dei vaccini contro il COVID-19.
Come vi ho illustrato nei precedenti articoli di questa rubrica, lo sviluppo di terapie basate sull’RNA si deve confrontare con importanti difficoltà che sono legate a:
- La veloce degradazione dell’RNA esogeno da parte delle ribonucleasi (RNAsi), enzimi che scindono enzimaticamente l’RNA.
- Il trasporto della molecola RNA, caratterizzata da una carica negativa, attraverso la membrana citoplasmatica idrofobica.
- La forte immunogenicità dell’mRNA esogeno che può produrre gravi fenomeni avversi nell’organismo ospite.
Questi ostacoli sono stati superati in anni recenti mediate i progressi acquisiti nella conoscenza biologica dell’RNA, nella bioinformatica, nelle nanotecnologie e nella chimica analitica (in particolare la scienza della separazione).
Silenziamento genico
Il silenziamento genico è un processo di controllo dell’espressione genica post-trascrizionale che sfrutta la capacità di una sequenza oligonucleotidica “antisenso” di ibridizzarsi con uno specifico mRNA target (obiettivo) caratterizzato dal “senso” e cioè dalla capacità di poter esprimere un’istruzione genica ‘sensata’. Una volta legatosi all’mRNA l’antisenso lo rende inaccessibile per la traduzione nella proteina corrispondente e ne determina la sua degradazione da parte di specifiche nucleasi.
- Interferenza dell’RNA (RNAi): è il meccanismo mediante il quale alcuni frammenti di RNA (oligonucleotidi) sono in grado di interferire con l’espressione genica e quindi bloccarla.
- Oligonucleotidi antisenso (ASO) consiste nell’utilizzo di brevi frammenti di DNA o di RNA che, contenendo una sequenza nucleotidica complementare all’ RNA messaggero (senso) si appaia ad esso annullandone l’attività biologica. In questo modo la molecola di mRNA, legata ad uno specifico oligonucleotide ASO, non è più in grado di essere tradotta.
- Aptameri RNA. Si tratta di una classe speciale di molecole di acido nucleico (DNA o RNA) che possono formare strutture tridimensionali in grado di legarsi in modo specifico a bersagli molecolari come piccole molecole, proteine, acidi nucleici etc. inibendoli. La loro più importante applicazione è nella terapia antitumorale.
Interferenza dell’RNA (RNAi, RNA interference)
Il processo di interferenza dell’RNA (RNA interference, RNAi) è un meccanismo di silenziamento genico post-trascrizionale basato sulla capacità di frammenti di RNA a doppio filamento non codificanti (double stranded RNA, dsRNA) di inibire l’espressione di uno specifico gene attraverso l’accoppiamento con l’mRNA bersaglio.
Il risultato finale è l’inibizione dell’espressione di uno specifico gene. Con la scoperta di questo meccanismo nel 2006 Craig Cameron Mello e Andrew Fire hanno vinto il Premio Nobel per la Medicina.
Nucleotidi antisenso (ASO), Small Interfering RNA (siRNA) e microRNA
Gli oligonucleotidi antisenso (ASO) sono brevi sequenze nucleotidiche a singolo filamento di DNA (o di RNA) disegnate per legarsi in modo specifico a un mRNA al fine di inibire la sintesi della proteina codificata. Gli ASO hanno però una bassa affinità per l’mRNA bersaglio e quindi sono state introdotte modificazioni chimiche per permettere loro di svolgere la loro funzione in maniera efficace. Inoltre essi sono soggetti a rapida degradazione da parte delle nucleasi ed anche qui sono state apportate delle modificazioni strutturali per renderle più stabili. Come nel caso dell’mRNA la somministrazione di ASO può avere effetti tossici legati all’induzione di una risposta infiammatoria indesiderata. Un noto effetto collaterale osservato con la somministrazione di ASO è la comparsa di trombocitopenia, che può coinvolgere una percentuale dal 20% al 60% dei pazienti trattati.
Nel seguente video dell’Università di Oxford sono approfonditi i concetti che vi ho appena esposto.
Aptameri RNA
Gli aptameri sono brevi acidi nucleici a singolo filamento, composti di circa 20/80 basi. Hanno la capacità, in virtù della loro struttura terziaria, di legarsi a una varietà di bersagli come proteine, peptidi, carboidrati ed altri tipi di molecole. Il loro meccanismo d’azione mima quello degli anticorpi monoclonali ed hanno un grande potenziale per sostituirli negli utilizzi terapeutici perché possono essere sintetizzati chimicamente, sono più convenienti da produrre, più semplici da modificare ed hanno bassa immunogenicità. Tuttavia, nonostante il fatto che gli aptameri abbiano molti vantaggi rispetto agli anticorpi, il loro utilizzo clinico è ostacolato dalle loro proprietà farmacocinetiche scarse (sono altamente sensibili alle nucleasi e sono velocemente escreti dai reni) e della complessità delle tecniche di estrazione.
Sebbene siano promettenti agenti terapeutici ad oggi sul mercato esiste un solo farmaco a base di aptameri approvato dalla FDA.
Premio Nobel
Gli studi sul silenziamento genico hanno permesso ad Andrew Fire (Università di Stanford) e Craig C. Mello (Università del Massachusetts) di ottenere nel 2006 il premio Nobel per la Medicina sulla base dei loro studi sulla RNAi.
Farmaci esistenti ed utilizzati
Di seguito troverete una lista di alcuni dei farmaci approvati dall’EMA (Agenzia Europea per i Medicinali) ed il loro relativo utilizzo clinico.
Amiloidosi ereditaria mediata dalla transtiretina
Le amiloidosi sono un grande gruppo di patologie che si caratterizzano per l’accumulo anomalo extracellulare di un materiale proteico insolubile, l’amiloide. L’amiloidosi ereditaria mediata dalla transtiretina (amiloidosi hATTR) è una malattia autosomica dominante, con esordio in età adulta, causata dal progressivo accumulo di depositi di amiloide formati da questa proteina. È una patologia multisistemica ed è caratterizzata da manifestazioni cliniche eterogenee, con interessamento di reni, cuore, apparato gastrointestinale, fegato, cute, nervi periferici e occhi.
Il Patisiran è un farmaco basato su tecnologia siRNA ed è indicato per il trattamento di tale forma di amiloidosi. Il farmaco è prodotto sotto forma di nanoparticelle lipidiche che permettono di veicolare lo siRNA agli epatociti che sono i maggiori produttori della proteina TTR presente in circolo. Questo principio attivo è stato approvato dall’EMA nel 2018.
Porfiria epatica acuta
Come sappiamo le porfirie sono un gruppo eterogeneo di malattie metaboliche rare causate da un deficit di uno degli enzimi della biosintesi dell’eme, molecola fondamentale per il trasporto dell’ossigeno nel sangue ed appartenente alla famiglia di composti chiamati porfirine. Tali deficit provocano un accumulo dannoso di porfirine, e di loro precursori, nel fegato e nel midollo osseo. Le porfirie sono principalmente classificate in epatiche od eritropoietiche. Sono patologie caratterizzate da sintomi neurologici (attacchi neuroviscerali), da lesioni cutanee correlate a fotosensibilità o dalla combinazione di entrambi. Le forme epatiche sono malattie rare e debilitanti.
Il Givosiran è un farmaco basato sulla tecnologia siRNA , la Commissione Europea del Farmaco (EMA) lo ha approvato per il trattamento della porfiria epatica acuta in pazienti adulti e adolescenti a partire dai 12 anni d’età. È il primo trattamento specifico per questa malattia approvato in Europa. È stato approvato dall’EMA nel 2020.
A questo link troverete la pubblicazione relativa al caso clinico di una paziente tedesca che, divenuta tetraplegica a causa della patologia, dopo un anno di terapia con il soppressore genico ha ricominciato a camminare. Oltre ad essere risolutiva la terapia non ha mostrata effetti collaterali rilevanti.
Personaggi famosi della nostra storia probabilmente hanno sofferto di porfiria epatica intermittente: Van Gogh, Re Giorgio III d’Inghilterra, Jean Jaques Rousseau, Søren Kierkegaard. Forse Van Gogh non era pazzo ma, piuttosto, malato.
Dislipidemie
Nell’ambito dei numerosi farmaci per il controllo dell’ipercolesterolemia occupano uno spazio sempre più importante quelli basati sul silenziamento genico quali gli inibitori dell’apolipoproteina B (Mipomersen) o di PCSK9 (Inclisiran).
L’Inclisiran è una sostanza attiva approvata dall’EMA per l’ipercolesterolemia e le dislipidemie. È somministrato in combinazione con una statina quando la dose massima di quest’ultima non abbassa sufficientemente i livelli di colesterolo. Può anche essere utilizzato in combinazione con altri farmaci per abbassare i livelli di colesterolemia nei pazienti che non possono assumere una statine.
Negli studi più recenti determina una riduzione efficace e prolungata del colesterolo LDL ed è basato sulla tecnologia siRNA. È stato anch’esso approvato nel 2020 dall’EMA.
Patologie neuromuscolari
L’atrofia muscolare spinale (SMA) è una malattia neuromuscolare di tipo genetico ereditario a trasmissione autosomica prevalentemente recessiva. Tutte le forme di SMA sono associate ad una mutazione di un gene chiamato SMN1 che codifica per una proteina chiamata SMN (Survival of motoneurons). La mutazione si associa alla progressiva perdita di motoneuroni del midollo spinale adibiti al controllo del movimento muscolare. Nella maggior parte dei casi si manifesta poco dopo la nascita e può essere fatale anche nel primo anno di vita.
Per la SMA è stato sviluppato il Nusinersen che è un oligonucleotide antisenso (ASO) il quale attiva la funzione del gene SMN2. Questo gene è complementare a quello inattivo (SMN1) e quindi determina la sintesi della proteina carente nelle cellule nervose dei pazienti affetti da SMA. È stato approvato dall’EMA nel 2017.
Future applicazioni delle terapie di Silenziamento Genico
Neoplasie
Sappiamo che i tumori sono il risultato dell’accumulo di vari tipi di mutazioni geniche e della regolazione delle reti geniche che si formano a seguito dell’interazione di questi geni mutati. La valutazione e l’interpretazione delle reti genetiche rientra nel campo più ampio della biologia dei sistemi, scienza che emerge sempre più rapidamente, soprattutto per la sua applicazione nella comprensione della complessità dei segnali intercellulari nel contesto della biologia del cancro. In questo contesto le terapie di soppressione genica assumono una rilevanza fondamentale. L’espressione dei geni correlati al cancro viene ‘spenta’ dalla RNAi, impedendo quindi lo sviluppo del tumore il tutto con bassi effetti collaterali e basso rischio. Ne consegue che il cancro è uno degli obiettivi primari dello studio e dello sviluppo dei farmaci ad RNAi. Tra i principali tumori oggetto degli attuali studi annoveriamo quelli del polmone, del pancreas, della mammella e del colon-retto.
Il ruolo dell’Intelligenza Artificiale (IA) e delle Nanotecnologie
Come è facile immaginare nello sviluppo di questa nuova categoria di farmaci il ruolo dell’IA e delle nanotecnologie è cruciale. In particolare vengono utilizzati algoritmi di machine learning e data mining sviluppati ad hoc per gestire i complessi problemi biologici che debbono essere affrontati come il rilevamento delle firme genetiche, dei biomarcatori, dei moduli genici e via discorrendo.
Sono stati inoltre sviluppati vari algoritmi di deep learning per selezionare siRNA più efficaci nel silenziamento genico. Obiettivo di questi approcci è quello di aiutare a selezionare il candidato siRNA per lo specifico mRNA target e migliorare lo sviluppo dell’interferenza dell’RNA.
Nel caso vogliate avere una panoramica sui software di IA e le nanotecnologie utilizzate in questo settore potete leggere l’articolo su ‘Farmaci e Vaccini mRNA, Intelligenza Artificiale e Nanotecnologie’.
Nel contesto di questo articolo non è stato affrontato il capito relativo ad altri tipi di RNA, prevalentemente sintetici, che sono oggetto di studi estremamente interessanti. Potete averne una panoramica nell’articolo ‘Endless RNA (eRNA), oRNA e lo scenario futuro della terapia medica dopo i vaccini ad RNA messaggero (mRNA)’
A presto
Per contattare l’autore potete scrivere una mail a: comunicazione@cassagaleno.it
*Riccardo Bugliosi è medico, specialista in Medicina Interna. Ha pregressi studi universitari in Fisica ed Ingegneria Elettronica. Esperto di Intelligenza Artificiale lavora nell’ICT. Le sue pubblicazioni sono facilmente reperibili sul web.
